Kromatografi (dasar)

ngik ngok tiba-tiba dapet kejutan listrik untuk menulis ini. walau sebenarnya juga masih pemula tentang kromatografi yang baru didapat di semester ini, tp sekalian belajarlah.🙂

Apa itu Kromatografi?
Kalau bicara tentang kromatografi pasti ada beberapa definisi dengan kata-kata yang beda. Salah satunya menyebutkan bahwa,

“Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak.”

Dari pengertian di atas dapat diketahui kalo ada dua komponen penting dalam kromatografi yaitu fase diam dan fase gerak. Dan perlu dicatat bahwa hasil pemisahan kromatografi yang baik bukan lagi berbentuk senyawa melainkan berbentuk tunggal.

Fase diam (Stationary phase)

Fase diam merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi. kenapa? karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit.

Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

Fase gerak (Mobile phase)

Fase gerak merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Nah fase gerak ini g melulu hanya cairan. Tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil)

Pemisahan dengan kromatografi

Pemisahan dengan kromatografi sendiri lebih baik daripada ekstraksi. kenapa? Karena sering diibaratkan dengan corong pisah yang saling berhubungan yang bergerak dari atas ke bawah dimana pada setiap corong pisah terjadi pemisahan. Selain itu permukaan antar fase pada kromatografi lebih besar.

Lalu apa yang menyebabkan senyawa tersebut dapat dipisahkan?

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya kalo pemisahan senyawa-senyawa dapat diamati dengan perbedaan waktu retensi (tR) pada kromatogram.

“Waktu retensi (tR) adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari awal kolom sampai ke detektor”

Semakin lama analit berinteraksi dengan fase diam –> semakin lama ia keluar –> tR semakin besar

Sehingga ada suatu konstanta yang menyatakan kecepatan migrasi solut melalui fase diam. Kecepatan migrasi solut dipengarui oleh perbandingan distribusinya (Kd atau kadang disebut D) yang ditentukan oleh afinitas relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak:

Kd = Kadar senyawa dalam fase diam/Kadar senyawa dalam fase gerak

Dari persamaan tersebut dapat ditarik kesimpulan kalo semakin besar harga Kd suatu senyawa maka waktu retensinya (tR) akan semakin besar karena interaksi dengan fase diam besar dan migrasinya semakin lambat.

 

Parameter kinetika pemisahan

Faktor Selektifitas (α)

“Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-senyawa dalam campuran”

untuk mendapat selektifitas yang maksimum maka harus dicari interaksi yang sesuai (apakah partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Faktor selektifitas (α) dapat dicari dengan:

α = k2/k1 = (tR2-tm)/(tR1-tm)

Apabila kedua senyawa memiliki nilai K yang sama / α = 1 maka kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. karena waktu retensinya identik.

Faktor Spesifisitas (Kd)

Sifat spesifisitas dari kromatografi didasarkan pada sifat dari senyawa yang spesifik. Senyawa memiliki sifat spesifik karena memiliki Kd yang spesifik.

Kapasitas Kolom (K’)

Menunjukkan kemampuan kolom menampung analit. Semakin lama analit berada dalam kolom, akan semakinb esar nilai kapasitasnya. Nilai K’ yang bagus antara 1-10. Jika k’ terlalu kecil, kemungkinan pemisahannya belum sempurna dan jika terlalu besar maka akan terjadi pelebaran puncak.

Resolusi (Rs)

Untuk taraf kepercayaan 95%, harga Rs yang baik adalah > 1,5. Jika kurang dari ini maka puncak dari masing2 analit akan saling tumpang tindih

Jumlah Lempeng Teoritis (Neff)

Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi.

Interaksi Analit dan Fase diam

Setelah tahu tentang konsep pemisahan nyambung kesini. Sebenarnya secara sederhana mekanisme pemisahan analit dibedakan menjadi 4, hal ini yang mengakibatkan perbedaan waktu retensi karena perbedaan interaksi analit dengan fase diamnya.

1. Adsorbsi

Fase diam: Padatan

Fase gerak: Cair (bisa juga gas pada Kromatografi padat-gas)

Dasar pemisahan: Stereokimia

2. Partisi

Fase diam: Cair

Fase gerak: Cair atau gas (pada kromatografi cair-gas)

Dasar pemisahan: Partisi-konsep like dissolves like

Untuk kromatografi jenis ini dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika kimia dengan fase diam akan tertambat lebih lama pada fase diam –> tR lebih besar

Sebagai contoh jika kita ingin memisahkan kafein dan parasetamol pada sampel obat flu (kaya praktikum HPLC hehe) dengan fase diam ODS (Oktadesil silika) yang nonpolar. maka parasetamol akan lebih dulu keluar dari kolom atau tR lebih kecil daripada kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan lebih terlarut pada fase diam. sedangkan parasetamol bisa terlarut dikit tp cuma sebentar.

3.  Penukar ion (bahasa kerennya: ion exchange)

mekanisme pemisahan karena interaksi ionik antara fase diam dan solut. biasanya dipake di pabrik farmasi untuk bikin air bebas ion (sori lupa namanya haha). berdasarkan muatan yang dilapiskan pada fase diam, dapat dibagi 2:

a. Penukar anion: Fase diamnya muatan positif sehingga yang bermuatan negatif akan ketarik fase diam

b. Penukar kation: Fase diamnya bermuatan negatif sehingga yang bermuatan positif akan ketarik fase diam

4. Ekslusi ukuran (bahasa kerennya: Size Exclusion Chromatography)

Prinsip kerjanya pemisahan analit berdasarkan ukuran. Biasanya pake fase diam dengan pori berukuran tertentu.

Jadi ntar saat elusi, molekul yang kecil akan masuk ke pori fase diam. semakin kecil maka dapat masuk semakin dalam. sedangkan molekul yg besar dia g bisa masuk ke pori sehingga langsung terelusi.

Kesimpulannya: Partikel dengan ukuran besar (BM besar) memiliki tR lebih kecil daripada partikel dengan ukuran kecil (BM kecil)

Pelebaran puncak kromatogram

Selesai dipisahkan di kolom, dibawa ke detektor dan dicetak oleh rekorder maka kita dapat yang namanya kromatogram. Secara resmi yg ada di buku B) kromatogram merupakan profil konsentrasi yang simetri dalam arah aliran fase gerak (?)

gampangnya sih yang sumbu x itu waktu, sumbu y signal yg diterima detektor

Kromatogram yang ideal alias yg bagus yaitu yang tinggi, ramping dan tidak saling tindih antar satu puncak dengan lain. Namun kadang (bahkan sering sih) terjadi pelebaran puncak kromatogram. Apa aja penyebabnya:

1. Eddy diffusion

Kolom kan dikemas pake partikel fase diam yang kecil. Trus fase gerak lewat sambil bawa analit. Nah ada beberapa analit yang bisa lewat dengan mudah trus sampe detektor daripada beberapa partikel yang mengalami pengalihan (diversi) karena jalannya belok2. Buat lebih jelasnya liat di gambar:

Di gambar di atas kan bisa dilihat bahwa partikel B “beruntung” jalan yg dilewati tiada hambatan. ia tinggal lurus tanpa susah-susah. Beda dengan A dan C. Mereka berdua harus susah payah nglewatin halangan rintangan partikel fase diam. Partikel C halangannya lebih sedikit dari partikel B sehingga nyampe ke detektor setelah A. Sedangkan A harus belok jauh nyari jalan baru bisa nyampe.

Untuk meminimalkannya dengan pake kolom dengan partikel yang homogen densitasnya.

2. Longitudinal diffusion

Biasanya terjadi jika kecepatan alir fase gerak lambat. Pada keadaan tersebut, aliran fase gerak dengan analit di yang dekat dengan fase diam akan lambat karena adanya Vander walls force sedangkan yang berada di tengah lebih cepat alirannya namun konsentrasinya lebih kecil daripada yang samping. Karenanya analit yang semula tertahan oleh gaya Vanderwalls di samping akan berdifusi ke tengah sesuai dengan hukum Ficks.

Cara meminimalkannya: mempercepat laju alir dan menurunkan temperatur.

3. Mass transfer equilibrum

Kalo yang ini biasanya terjadi kalo laju alir terlalu cepat dan pemisahan pada kolom belum tercapai sempurna.

Cara meminimalkannya:

a. pake partikel kecil, karena luas permukaan besar sehingga kesetimbangan cepat tercapai

b. Menaikkan temperatur

c. Laju alir diperlambat

Jika faktor-faktor tersebut dibuat suatu kurva dengan H(tinggi lempeng teoritis) sebagai sumbu y dan V (kecepatan alir) sebagai sumbu x, maka akan didapat kecepatan alir optimum. Kurva ini disebut dengan kurva Van deemter.

Kurva van deemter ini didapat dari persamaan van deemter:

H = A+B/u+Cu
dimana A merupakan konstanta difusi eddy, B merupakan konstanta difusi longitudinal, C merupakan konstanta transfer massa, dan u merupakan laju alir fase gerak.

Dari persamaan tersebut dapat dilihat bahwa efisiensi pemisahan pada kromatografi bergantung pada ketiga faktor diatas, dan pelebaran puncak yang disebabkan oleh difusi longitudinal dan transfer massa bergantung pada laju alir fase gerak (seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya). Karenanya dari kurva van deemter dapat diperoleh laju alir fase gerak yang optimum.

Dari kedua gambar di atas kurva paling atas (yg ada tulisan HETP) merupakan resultan dari ketiga gaya tsb. Semakin tinggi resultan –> HETP semakin tinggi berarti efisiensi kolom lebih jelek.

Sedangkan makin rendah resultan –> HETP makin rendah efisiensi kolom lebih baik.

Kenapa?

Karena ada rumus lagi yaitu:
Jumlah lempeng teoritis = Panjang kolom / HETP (lebar lempeng teoritis)

atau

N = L / HETP

Efisiensi kolom meningkat jika N / jumlah lempeng teoritis meningkat. Kenapa? Karena semakin banyak lempeng teoritis maka pemisahan semakin baik (diumpamakan semakin banyak pula corong pisahnya ekstraksinya lebih baik). Semakin panjang L (panjang kolom) maka semakin banyak jumlah lempeng teoritis dan efisiensi semakin bagus.

Namun bila HETP lebih besar efisiensi kolom jelek. kenapa? Karena berarti lebar untuk 1 kolom teoritis lebih besar sehingga dalam kolom yg panjangnya sama, jumlah lempeng teoritisnya lebih sedikit. Misalnya ada dua kolom, dimana panjang kolom (L) nya sama2 100 cm. Kolom 1 HETPnya 5 cm sedangkan kolom 2 HETPnya 10 cm. Berarti dalam kolom 1 ada 20 lempeng teoritis kan (dari 100/5) ? lebih besar daripada di kolom 2 yg lempeng teoritisnya cuma 10 (100/10)

About denikrisna

An ordinary boy. a future pharmacist

Posted on Oktober 23, 2010, in Kromatografi and tagged . Bookmark the permalink. 19 Komentar.

  1. mantap aq tunggu posting berikutnya

  2. kok faktor2 kromatografinya ga lengkap???

  3. bsa tidak lebih didetailkan lagi faktor-faktor kromatografi, karena penjelasan diatas lebih mengarah kearah faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan Rf….
    thx b4

  4. kalo % diff untuk uji akurasi maksudnya apa yaa??

  5. minta penjelasan ttg faktor2 yg mempengaruhi Rf pada KLT dunk..

    • Rf kan adalah (jarak retensi senyawa uji+fase gerak) dibanding (jarak retensi fase gerak)
      Jadi faktor2 yang mempengaruhi Rf adalah faktor2 yang mempengaruhi jarak retensi:
      1. Polaritas solven
      2. pH solven
      3. temperatur

  6. rumus menghitung nilai resolusinya ko ga ada si????????????????

  7. Makasih tulisannya sangat membantu, menambah ilmu mengenai kromatografi.

  8. untuk fase diam yg padat ada fotonya tidak?
    itu jika beli kolom secara otomatis ada fase diamnya?
    lalu bagaimana sistem kerjanya sehingga bisa memisahkan komponen?
    Mohon dijelaskan

  9. makasi post nya.., membantu

  10. thx bgt yah,,,menambah ilmu nih….:)

  11. Terima kasih banyak. Sangat membantu saat belajar untuk UAS😀

  12. Hi, this weekend is fastidious for me, as this time i am reading this great educational post here at my home.

  13. makasih banget,,,,posnya sangat memebantu,,>_<

  14. duh, makasih banget loh ya.. aku juga lagi pelajari materi tentang kromatografi. bahasa yang kamu gunakan cukup enak dibaca jadi mudah dipahami. ^^

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

%d blogger menyukai ini: